Prüflabor Mikrobiologie
Akkreditiert nach ISO 17025 für die Prüfung von Medizinprodukten und Arzneimitteln.

Unser mikrobiologisches Prüflabor ist akkreditiert nach ISO 17025 und verfügt über eine GMP-Zertifizierung.

Wir bieten umfassende Dienstleistungen im Bereich der Mikrobiologie. Durch unsere langjährige Erfahrung und Kompetenz können wir Ihnen Komplettlösungen zur Verfügung stellen, die von der Entwicklung und Validierung produktspezifischer Prüfmethoden über die Produktionsüberwachung bis zur Endprüfung der Produkte reichen.

Unsere Mikrobiologen beraten Sie in allen Fragen der Sterilisationssicherheit, der mikrobiologischen Qualität Ihrer Produkte, der betrieblichen Hygiene- und Validierungsaktivitäten.

Unser Dienstleistungsangebot umfasst die folgenden Methoden:

  • Keimzahlbestimmung / Bioburden an Medizinprodukten und Arzneimitteln gemäß ISO 11737 bzw. Ph. Eur. 2.6.12   [Mehr]
  • Sterilitätsprüfung von Medizinprodukten und Prüfung auf Sterilität von Arzneimitteln gemäß ISO 11737 bzw. Ph. Eur. 2.6.1   [Mehr]
  • Validierung der mikrobiologischen Prüfmethoden (Keimzahlbestimmung und Sterilitätsprüfung) gemäß den o.g. ISO-Standards bzw. Arzneibuchmethoden   [Mehr]
  • mikrobiologische Validierung der Gammasterilisation nach ISO 11137   [Mehr]
  • Validierung weiterer Sterilisationsverfahren (z.B. Dampfsterilisation, nicht standardisierte Sterilisationsverfahren gemäß ISO 17665, ISO 14937, ISO 14160)   [Mehr]
  • Validierung aseptischer Produktionsprozesse gemäß ISO 13408
  • Keimidentifizierung   [Mehr]
  • Prüfung auf Bakterien Endotoxine gemäß Ph. Eur. 2.6.14 bzw. 5.1.10, gemäß ANSI AAMI ST 72 und USP Kapitel 85 und 161 [Mehr]
  • mikrobiologisch-hygienische Prüfungen der Luft und Oberflächen im Reinraum (auch vor Ort) gemäß ISO 14664, ISO 14698 bzw. EU-GMP-Leitfaden Annex 1 (Betriebshygiene)   [Mehr]

Keimzahlbestimmung / Bioburden an Medizinprodukten und Arzneimitteln gemäß ISO 11737 bzw. Ph. Eur. 2.6.12

Unter dem Begriff Keimzahl oder Bioburden versteht man die Art und Zahl der nachweisbaren Keime, die sich vor der Sterilisation auf einem Produkt befinden.

Für diesen Nachweis wird eine Probe in einer geeigneten Prüflösung entweder aufgelöst oder die Keime abgespült und anschließend kultiviert. Im Ergebnis erhält man klassischerweise eine Anzahl von gewachsenen Kolonien, weshalb das Ergebnis in koloniebildenden Einheiten (KBE) ausgedrückt wird.

Um die Art und Zahl der Mikroorganismen korrekt festzustellen ist eine umfassende Validierung der Bestimmungsmethode notwendig.

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Sterilitätsprüfung von Medizinprodukten und Prüfung auf Sterilität von Arzneimitteln gemäß ISO 11737 bzw. Ph. Eur. 2.6.1

Wir führen für unsere Kunden die Sterilitätsprüfung nach gängiger Arzneibuchmethode für Arzneimittel oder gemäß ISO 11737 für Medizinprodukte durch. Dabei verwenden wir folgende Verfahren:

  • Direktbeschickungsverfahren
  • Membranfiltration

Die Sterilitätsprüfung von Medizinprodukten erfolgt bevorzugt im Direktbeschickungsverfahren, bei dem die zu prüfenden Produkte für 14 Tage mit einem für Mikroorganismen geeignetem Medium bei bestimmten Temperaturbedingungen inkubieren.

Für die Sterilitätsprüfung von Arzneimitteln sowie bei Medizinprodukten mit wachstumshemmenden Einflüssen wird das in Lösung befindliche Arzneimittel oder ein Extrakt des Medizinproduktes direkt über einen Membranfilter gefiltert. Dieser Membranfilter wird dann ebenso wie beim direkten Ansatzverfahren für 14 Tage in geeigneten Medium inkubiert.

Die visuelle Bewertung des Steriltestansatzes auf Keimwachstum erfolgt nach 14 Tagen Inkubationszeit.

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Validierung der mikrobiologischen Prüfmethoden (Keimzahlbestimmung und Sterilitätsprüfung) gemäß ISO 11737 bzw. Ph. Eur. 2.6.1 und 2.6.12

Nach der Intention des Arzneibuchs gelten die dort beschriebenen Prüfmethoden bereits als validiert. Allerdings müssen diese Methoden noch daraufhin überprüft werden, ob sie zur Untersuchung der spezifischen Probe grundsätzlich geeignet sind.

Bei den mikrobiologischen Prüfmethoden erfolgt dies durch eine sog. Wachstumseignungsprüfung, häufig auch als Bakteriostase-/Fungistasetest bezeichnet. Dabei wird geprüft, ob bestimmte Referenzkeime in An- und Abwesenheit des zu prüfenden Produkts gleichermaßen gute Wachstumsreaktionen zeigen.

Der ISO-Standard geht deutlich über die Anforderungen des Arzneibuchs hinaus, da nicht nur eine Überprüfung der Wachstumsbedingungen anhand von Referenzkeimen gefordert wird. Zusätzlich zum Bakteriostase-/Fungistasetest wird hier eine vergleichende Keimzahlbestimmung unter Verwendung verschiedener Nährmedien und Inkubationsbedingungen durchgeführt, um zu prüfen, unter welchen Bedingungen die meisten Keime und Keimarten erfasst werden. Da Medizinprodukte (im Gegensatz zu Arzneimitteln) meist extrahiert werden müssen, um die anhaftenden Keime abzulösen und in die Prüflösung zu überführen, ist in der Regel auch eine Überprüfung des Keimablöseverfahrens notwendig, um die Wiederfindungsrate zu ermitteln und einen Korrekturfaktor daraus abzuleiten.

Besonders komplex stellt sich die Prüfung dar, wenn die Proben beispielsweise Antibiotika enthalten oder wenn es sich um schwammartige Produkte handelt. Solche Produkte können den Ablösungsprozess der Keime immens verschlechtern. Antibiotika-haltige Produkte können womöglich toxische Effekte auf die Keime während des Ablöseprozesses hervorrufen.

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Mikrobiologische Validierung der Gammasterilisation gemäß ISO 11137

Neben der anwendungstechnischen Validierung und der Dosisverteilungsmessung erfordert die Gammasterilisation auch eine mikrobiologische Sterilisationsvalidierung.

Dabei handelt es sich um die Mindestbestrahlungsdosis, die benötigt wird, um das Produkt in den sterilen Zustand zu überführen. Hierzu wird der mikrobiologische Ausgangszustand – Anzahl und Art der Mikroorganismen – bestimmt. Anhand des Ausgangszustands wird eine bestimmte Dosis, die Verifizierungsdosis ermittelt. Die Produkte werden mit dieser Verifizierungsdosis bestrahlt und anschließend auf Sterilität geprüft. Verlief die Überprüfung der Verifizierungsdosis durch die Sterilitätsprüfung erfolgreich, so ist die Sterilisationsdosis bestätigt. Dabei kann garantiert werden, dass die validierte Sterilisationsdosis einen Sterility Assurance Level (SAL) von 10-6 erzielt.

Die Sterilisationsvalidierungen basieren in unserem Haus auf den folgenden Normen ISO 11137-1, ISO 11137-2, ISO 11737-1, ISO 11737-2 und EN 556.

Soweit möglich, empfehlen wir das sogenannte VDmax25-Verfahren und Verfahren I. Die Methode VDmax25 ist für die Validierung der Sterilisation mit einer Mindestdosis von 25 kGy (dem üblichen Verfahren) und einer Vorverkeimung von nicht mehr als 1000 KBE/Produkteinheit geeignet.

Neben der VDmax25 Methode kann auch die  Methode I (Dose Setting) eingesetzt werden. Diese Methode eignet sich dazu, eine Mindestbestrahlungsdosis zu ermitteln, die für eine erfolgreiche Sterilisation notwendig ist. Mit diesem Verfahren können bei nachweislich geringen Verkeimungsraten, niedrigere Sterilisationsdosen validiert werden.

Revalidierung / Dose Audits der Gammasterilisation

Des Weiteren bieten wir unseren Kunden die Sterilisationsdosisüberprüfung zum Nachweis der beständigen Wirksamkeit durch eine üblicherweise quartalsweise Revalidierung (Dose Audit) an. Im Vergleich zur mikrobiologischen Validierung benötigen wir hier nur einen Bruchteil der Prüfmuster. Das Dose Audit setzt sich aus einer Keimzahlbestimmung (Bioburden) und einer Überprüfung der in der Validierung festgelegten Verifizierungsdosis zusammen.

Sonderwünsche Gammasterilisation

Auf Kundenwunsch können in unserem Haus Einzelchargenvalidierungen und VDmaxSD-Methoden gemäß ISO/TS 13004 durchgeführt werden.

Mit unserer langjährigen Expertise beraten wir Sie jederzeit umfassend über die Auswahl des für Ihr Produkt am besten geeigneten Validierungsverfahrens.

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Validierung weiterer Sterilisationsverfahren

Wir haben in unserem Haus umfangreiche Erfahrung in der

  • allgemeinen Sterilisationsvalidierung nach ISO 14937
  • Sterilisation mit flüssigen/chemischen Sterilisationsmitteln gemäß ISO 14160
  • Validierung der Dampfsterilisation gemäß ISO 17665
  • Validierung der Sterilisation durch Trockene Hitze gemäß ISO 20857

Gerne unterstützen wir Sie auch in der Entwicklung oder Validierung weiterer neuer bzw. nicht genormter Sterilisationsverfahren. Hierbei können Sie von unserer umfangreichen Erfahrung profitieren. So können wir Sie beispielsweise dabei unterstützen, die am schwierigsten zu inaktivierenden Keime des produktspezifischen Bioburden zu analysieren und deren Inaktivierungskinetik zu ermitteln. Darauf aufbauend kann dann die Validierung des Sterilisationsverfahrens in Angriff genommen werden.

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Keimidentifizierung

Eine effiziente Handlungsmöglichkeit bei ungewöhnlich hohen oder unerklärlichen Kontaminationen ist erst dann möglich, wenn der Keim korrekt identifiziert ist.

Wir bieten folgende Methoden zur Identifizierung an:

  • Überprüfung auf anaerobe Bakterien
    Hierbei werden die Keime unter anaeroben Bedingungen und unter aeroben Bedingungen kultiviert und somit die Anwesenheit anaerober Keime ausgeschlossen oder bestätigt.

  • Mikroskopische Identifizierung
    Diese Methode beinhaltet die makroskopische- und mikroskopische Beurteilung, Gramfärbung, Sporenfärbung zzgl. Schimmelidentifizierung.

  • Biochemische Identifizierung
    Bei einer biochemischen Identifizierung mittels „bunter Reihe“ wird das Wachstum mit verschiedenen Substraten geprüft und es wird geprüft, ob bestimmte Enzyme aktiv sind.
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Prüfung auf Bakterien Endotoxine und Pyrogene gemäß Ph. Eur. 2.6.14 bzw. 5.1.10, gemäß ANSI AAMI ST 72 und USP Kapitel 85 und 161 sowie Monozytenaktivierung gemäß Ph. Eur. 2.6.30

Die BBF Sterilisationsservice GmbH verfügt über langjährige Erfahrung und ausgewiesene Kompetenz beim Nachweis von Endotoxinen und Pyrogenen und führt diese Prüfung entsprechend der geltenden Normen und Regularien für Sie durch.

Pyrogene sind Substanzen, die bereits in kleinen Konzentrationen sowohl bei Menschen als auch bei Tieren Fieberreaktionen, Blutdruckabfall und lebensbedrohliche Schockzustände auslösen. Die wichtigste Gruppe der Pyrogene sind Lipopolysaccharide aus der Zellmembran gramnegativer Bakterien, üblicherweise als Endotoxine bezeichnet, die beim Absterben der Organismen bzw. der Auflösung der Zellmembran freigesetzt werden. Sie sind sehr hitzestabil und können durch gängige Sterilisationsverfahren nicht entfernt oder inaktiviert werden.

Daneben gibt es noch eine Reihe weiterer pyrogen wirkender Substanzen, z.B. Lipoteichonsäure grampositiver Bakterien, Viren, RNA usw.

Für die Endotoxinbestimmung werden die Einheiten in Endotoxin Units pro ml (EU/ml) angegeben. bei der Pyrogenbestimmung wird die Menge in Endotoxin-Äquivalenten Einheiten pro ml (EE/ml) angegeben. Der ermittelte Endotoxingehalt wird mit dem geltenden oder vom Kunden vorgegebenen Grenzwert abgeglichen.


Wir bieten die folgenden Endotoxin- und Pyrogenbestimmungsmethoden als Grenzwertprüfungen oder quantitative Prüfungen an:

Monozytenaktivierungstest zur Pyrogen- oder Endotoxinbestimmung gemäß Ph. Eur. 2.6.30

Der Monozyten-Aktivierungs-Test (MAT) weist mit hoher Empfindlichkeit proinflammatorische Zytokine nach, die von Monozyten im Blut nach Kontakt mit pyrogen wirkenden Substanzen ausgeschüttet werden und daraufhin die Fieberreaktion auslösen. Gegenüber dem Kaninchentest hat der MAT den Vorteil, dass er mit Human-Blut bzw. primären Blutzellen oder mit humanen monozytären Zelllinien arbeitet und somit ohne Versuchstiere auskommt. Wir verwenden für unseren Test qualifizierte periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von mindestens 4 Spendern und überprüfen die Anwesenheit von Pyrogenen durch die Ausschüttung des Zytokins Interleukin-6 (IL-6).

Im Rahmen der Pyrogenbestimmung ist es uns möglich die Pyrogenität durch die Menge der Endotoxin-Äquivalenten Einheiten pro ml (EE/ml) anzugeben. Innerhalb des Monozytenaktivierungstest ist es möglich die Potenz und Anwesenheit unterschiedlicher Pyrogene zu untersuchen (z.B. Lipopolysaccharide, Lipoteichonsäure oder nicht Bakterien-bedingte Endotoxine).

Gemäß der EU Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere soll alternativen Methoden gegenüber Tierversuchsmethoden der Vorzug gegeben werden. So soll etwa nach dem Europäischen Arzneibuch Kapitel 2.6.8 explizit, wenn immer möglich, der Kaninchen-Pyrogentest durch die Prüfung auf Monozytenaktivierung gemäß Ph. Eur. 2.6.30 ersetzt werden.

Limulus-Amöbozytenlysat-Test gemäß Ph. Eur. 2.6.14, ANSI AAMI ST 72 sowie USP Kapitel 86 und 161

Da der überwiegende Teil der Pyrogene auf Endotoxine, vor allem Lipopolysaccharide (Zellwandbestandteile gram-negativer Bakterien) zurückzuführen ist, wurde für deren Nachweis der Limulus-Amöbozytenlysat-Test (=LAL-Test) entwickelt. Für diesen Test verwendet man Komponenten aus dem Blut des Pfeilschwanzkrebses welche bei Kontakt mit Lipopolysacchariden koagulieren. Die Prüfung wird gemäß dem Ph. Eur. 2.6.14 und USP Kapitel 85 durchgeführt sowie im Bereich der Medizinprodukte gemäß ANSI AAMI ST 72 und USP Kapitel 161.

Der Test erfolgt bei uns hauptsächlich als Grenzwertprüfung. Das bedeutet unser Kunde definiert seinen Grenzwert, z.B. 20 EU je Produkteinheit und wir prüfen Verdünnungen unterhalb dieses Grenzwertes zur Sicherstellung der Akzeptanzkriterien. Der Endotoxingehalt kann wahlweise quantitativ bei uns bestimmt werden.

Für die Herstellung des Lysats müssen die Tiere einer riskanten Blutabnahme unterzogen werden. Außerdem reagiert das Lysat nicht nur auf Lipopolysaccharide sondern auch auf Beta-Glukane. Diese sind Polysaccharide welche in den Zellwänden von Pflanzen, Bakterien und Pilzen vorkommen, wie Cellulose oder Chitin.

Daher verwendet man in den letzten Jahren vorzugsweise biotechnologisch hergestellte Äquivalente. Siehe hierzu rekombinanter Faktor C-Test.

Rekombinanter Faktor C gemäß Ph. Eur. 5.1.10

Wir bieten die Prüfung zum Nachweis bakterieller Endotoxine durch den rekombinanten Faktor C-Test an. Dieser wird gemäß Kapitel 5.1.10 des Europäischen Arzneibuchs als Alternative Methode anstelle des Limulus-Amöbozytenlysat-Tests genannt.

Wir bieten hierzu zwei Systeme des Rekombinant Faktor C-Tests an, den typischen Rekombinant Faktor C-Test und den Test auf ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent-Assay) Basis zur Eliminierung von Störfaktoren im Vorfeld. Beide Testsysteme bieten die Möglichkeit zur quantitativen Bestimmung der Endotoxinmenge.

Für den rekombinanten Faktor C-Test wird das entscheidende Enzym, der sogenannte Faktor C, der üblicherweise im Blut der Pfeilschwanzkrebse vorfindbar ist, biotechnologisch hergestellt. Durch das reine Enzym werden falsch-positive Ergebnisse, die z.B. durch Beta-Glukane auftreten, eliminiert.



Die Vor- und Nachteile der einzelnen Nachweismethoden können der folgenden Tabelle entnommen werden:

Validierung der Pyrogen- und/oder Endotoxinbestimmung

Für die Validierung der Pyrogen- und/oder Endotoxinbestimmung werden, wenn möglich drei Chargen eines Produktes gemäß Kapitel 5.1.10 des Europäischen Arzneibuchs und gemäß ANSI AAMI ST72 zwei bis zehn Produkte je Charge überprüft, gemäß USP Kapitel 161 sollen 3 – 10 Produkte als Mischprobe überprüft werden.

Wichtig für den Nachweis auf Endotoxine sowie Pyrogene ist die Störfaktorenanalyse. Hierbei geht es darum in Anwesenheit des Produktes aufzuzeigen, dass das Nachweissystem nicht gestört wird. Hierzu wird eine bekannte Endotoxinmenge dem Ansatz zugegeben und anschließend überprüft ob diese Menge detektiert werden kann. Die Wiederfindung sollte zwischen 50 bis 200 % liegen um Störfaktoren auszuschließen.

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mikrobiologisch-hygienische Prüfungen der Luft und Oberflächen (auch vor Ort) gemäß ISO 14644, ISO 14698 bzw. EU-GMP Leitfaden Annex 1 (Betriebshygiene)

Sterile Medizinprodukte und Arzneimittel werden in Reinräumen gefertigt. Dabei spielt die Reinraumhygiene eine große Rolle und ist in den Normen ISO 14644, ISO 14698 sowie im Anhang 1 des EG-Leitfaden der Guten Herstellungspraxis (EU-GMP) geregelt.

Für die betriebshygienische Untersuchung der Reinräume werden verschiedene Methoden, wie z.B. Luftpartikelmessungen, Luftkeimzahlbestimmungen oder Oberflächen-Abklatschkontrollen durchgeführt.

Dabei können Sie die Probenahme für die mikrobiologischen Tests selbst durchführen und uns die angefertigten Proben zur Auswertung zusenden, oder Sie können uns mit der kompletten Durchführung einschließlich der Probenahme vor Ort in Ihrem Betrieb beauftragen.

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Ihre Ansprechpartner

Bei Fragen zu unseren Dienstleistungen sind unsere Ansprechpartner gern für Sie da.

Herr Dr. Norman Layh
Business Development
Herr Dr. Christopher Rösch
Herr Dr. Christopher Rösch
Prüflabor